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体外诊断试剂 / DNA甲基化相关资料 / 【原创】DNA甲基化——新一代癌症早期诊断指标（肺癌篇）

【原创】DNA甲基化——新一代癌症早期诊断指标（肺癌篇）

Tellgen

2017-12-07 13:51:54 阅读量:13933

导读：在全世界范围内，肺癌是威胁公众健康的头号恶性肿瘤，早期诊断可大大提高5年存活率。肺泡灌洗液（BALF）由于创伤小、毗邻肿瘤细胞，有望成为肺癌的早期诊断标本。然而，受诸多因素影响，BALF的细胞学检查灵敏度并不高。近年来，随着分子遗传学技术的发展，灵敏度高、特异性强的肿瘤标志基因检测被广泛地应用于临床诊断、治疗及预后评估。BALF遗传学标志物的检测有望辅助肺癌早期诊断。

1、肺癌与DNA甲基化

DNA甲基化是表型修饰的一种，与癌症的发生密切相关。尤其是CpG岛区的启动子超甲基化可能会导致抑癌基因转录沉默，从而影响肿瘤发生的进程。由于DNA甲基化几乎在所有癌症中均有发现，并且发生在癌前或者癌症早期阶段，因而有望成为癌症早期诊断的理想标志物。矮小同源盒基因（SHOX2）和RAS相关家族1A(RASSF1A)是常见的肺癌DNA甲基化标志物。

SHOX2属SHOX基因家族，位于3号染色体q25-q26.1区域，编码60个氨基酸构成的DNA结合区域蛋白,是一种常见的转录调控因子。RASSF1A是Ras信号通路的成员，位于3号染色体p21.3，调控细胞的增殖和自噬。研究显示，相比于肺腺癌，SHOX2基因甲基化检测对于小细胞肺癌和鳞癌具有更高的特异性。而RASSF1A的表达下调对肺腺癌的发展至关重要。

2、DNA甲基化检测方法

对于特定片段的甲基化检测方法很多，包括甲基化特异性PCR（MS-PCR）、亚硫酸盐处理+测序、联合亚硫酸盐的限制性内切酶法（COBRA）、焦磷酸测序、PCR荧光变性曲线分析及荧光定量法（MethyLight）等。

MS-PCR：DNA 经亚硫酸盐处理后, 非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶保持不变。在PCR 反应时, 有两套不同的引物对，分别针对经处理后的甲基化和非甲基化链，若甲基化的链被扩增出说明发检测位点生了甲基化，若非甲基化的链被扩增出，则说明无甲基化。

亚硫酸盐测序：DNA 经亚硫酸盐处理后，PCR扩增待测片段，随后对产物进行测序，并于未经处理的序列进行比对，判断是否发生甲基化。

COBRA：DNA经亚硫酸盐处理后, 对待测片段进行PCR扩增，并用限制性内切酶进行切割, 完全甲基化的片段可被识别切割，非甲基化的则不能被识别切割。对酶切产物进行电泳分析, 根据条带判断样本中甲基化程度。

焦磷酸法测序：通过酶级联反应每个dNTP的聚合与荧光信号的释放偶联，通过检测荧光的释放和强度，可实现DNA测序的目的。

PCR荧光变性曲线分析：DNA经亚硫酸盐处理后, 对待检DNA 片段进行PCR 扩增，检测DNA 结合染料的荧光强度，获得待检DNA 的熔解曲线。通过变性温度的不同即可区分甲基化与非甲基化的DNA。

MethyLight：此法结合了亚硫酸盐修饰与Taqman探针技术。DNA 经亚硫酸盐处理后, 非甲基化的C被修饰成U（扩增时被T取代），而甲基化C保持不变。随后的RT-PCR扩增过程中，对于甲基化的样本，探针可与待检位点杂交, PCR 延伸时，报告荧光基团会被Taq酶切下释放光信号, 而非甲基化样本则不能被引物结合扩增，通过检测荧光信号的强弱即可判断DNA 的甲基化状态。

张毅敏等、Ren等及Zhang等基于此法对临床上疑似肺癌患者的SHOX2和RASSF1A 基因进行了甲基化检测，并与测序法进行了比对。在张毅敏等的研究中，两种方法对SHOX2和RASSF1A 基因甲基化检测的一致率分别为97.5%和98.0%。Ren等的研究中，一致率则分别达到了99%和100%。Zhang等的研究中也表现出了极好的一致性。说明了此法用于甲基化检测的可靠性。与测序法相比，该法操作简单、成本低，且所需DNA样本量很少，减少了样本搜集难度，故有望取代前者的甲基化检测。

3、DNA甲基化检测助力肺癌临床诊断

3.1 大大高于传统指标的灵敏度和特异性

张毅敏等的研究结果显示，SHOX2和RASSF1A任意甲基化阳性对肺癌的敏感性和特异性分别为74.3%和87.1%。Ren等的研究结果与此十分接近，分别为71.5%和90%。而Zhang等则分别达到81.0%和97.4%。Zhang等还对细胞学和血清CEA对肺癌的灵敏度进行了统计，分别为68.3%和30.6%。

3.2 区分其他恶性肿瘤和良性疾病

三项研究中均用其他恶性肿瘤和良性疾病做了对照，甲基化阳性率均远远低于肺癌，因而提示SHOX2/RASSF1A甲基化检测有望用于区分肺癌和其他恶性肿瘤和良性疾病，具体数据见表1：

SHOX2/RASSF1A基因甲基化任意阳性率
	张毅敏	Ren	Zhang
肺癌	74.3%	71.5%	81.6%
良性肺病/其他恶性肿瘤	12.9%	10.0%	2.6%

3.3 重要的早期诊断价值

Zhang等的研究表明，BALF的SHOX2/RASSF1A甲基化检测对I期的肺癌患者有极高的检出率，为85.7%，远高于血清CEA和细胞学的10.7%和46.4%。Ren等的研究中SHOX2/RASSF1A甲基化对肺癌I期检出率则为70.2%。因此，SHOX2/RASSF1A甲基化对于肺癌的早期诊断具有重要意义。

4、jinnianhui金年会肺癌DNA甲基化检测试剂盒重磅上市

本文提及的几篇研究采用的都是jinnianhui金年会生命开发的国际首创专利产品——人SHOX2、RASSF1A基因甲基化DNA检测试剂盒（专利证号：ZL 2015 1 0203539.1），产品注册证号：国械20173403354，现已全面上市！此外，公司正在报批的同类产品还有结直肠癌Septin9甲基化检测试剂盒，敬请期待！

参考文献
张毅敏, 王明丽, 吴杰,等. 肺泡灌洗液中SHOX2和RASSF1A基因甲基化联合检测对肺癌的诊断价值[J]. 肿瘤学杂志, 2016, 22(12):1032-1036.
范保星. DNA甲基化检测方法[J]. 国际遗传学杂志, 2002, 25(2):99-101.
Ren M, Wang C, Sheng D, et al. Methylation analysis of SHOX2 and RASSF1A in bronchoalveolar lavage fluid for early lung cancer diagnosis.[J]. Annals of Diagnostic Pathology, 2017, 27:57-61.
Zhang C, Yu W, Wang L, et al. DNA Methylation Analysis of the SHOX2 and RASSF1A Panel in Bronchoalveolar Lavage Fluid for Lung Cancer Diagnosis. Journal of Cancer. 2017，8(17):3585-3591.

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